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大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)的步驟你有去了解過嗎?

更新時間:2021-12-06      點擊次數(shù):566
 
  大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)是將胚胎哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部分組織,如大腦皮層、海馬、脊髓等腦組織直接取出,再接種培養(yǎng)的方法。目前國內(nèi)、外有關(guān)神經(jīng)元培養(yǎng)的方法較多,但在原代培養(yǎng)中神經(jīng)元的純度和產(chǎn)量方面還存在一些急待解決的問題。由于神經(jīng)元是一種高度分化的細(xì)胞,相對于其它細(xì)胞而言,神經(jīng)元在體外更難以存活和生長。因此,體外培養(yǎng)神經(jīng)元要求的培養(yǎng)方法和營養(yǎng)條件均較為特殊。
  大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)的步驟:
  1、于無菌條件下切取鼠頭并以75%酒精浸泡1min,解剖出完整鼠腦;
  2、預(yù)冷解剖液中分離去除軟膜、血管、取大腦皮質(zhì)漂洗,用眼科剪將皮質(zhì)反復(fù)剪切成碎塊;
  3、移入培養(yǎng)皿中,吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2m1,37℃培養(yǎng)箱中消化30min;
  4、將皮層組織碎塊移入離心管,棄去剩余消化液,用接種液洗3次,每次洗滌后使組織塊充分沉降到試管底,棄去上清液;
  5、最后再用接種液1ml混懸,反復(fù)吹打(巴氏吸管)混懸液中組織塊,力度適中,至渾濁后將上清液移入培養(yǎng)瓶待用;
  6、加入1ml接種液后再次吹打,如此反復(fù)3-4次,組織塊逐漸消化后,棄去最終殘塊;
  7、收集含單細(xì)胞懸液的上清液約4-5ml于培養(yǎng)瓶中,以接種液重新懸浮細(xì)胞,細(xì)胞記數(shù);接種1x107個細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中;
  8、培養(yǎng)24h至細(xì)胞貼壁后,換全培養(yǎng)液(DMEM/F12+2%B27,engreen)培養(yǎng)3d,觀察神經(jīng)元生長狀況;
  9、換用阿糖胞苷培養(yǎng)液(終濃度2.5ug/ml,換半液)培養(yǎng)3d以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及雜細(xì)胞生長,獲得單純培養(yǎng)的原代神經(jīng)細(xì)胞;
  10、每隔3d換全培養(yǎng)液1次,每次換半液。
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