細胞鈣離子檢測實驗原理：

Fluo-3廣泛用于長波長的熒光鈣指示劑。其在506 nm處被吸收,可以被氬離子激光的488 nm激發(fā)光激發(fā),便于檢測。Fluo-3在沒有 同鈣結合的情況下,無熒光產(chǎn)生。但是,在與鈣結合后,熒光( 526 nm )增強至少40倍。Fluo-3/AM是一 種可以穿透細胞膜的熒光染料。 Fluo-3/AM的熒光非常弱 ,其熒光不會隨鈣離子濃度升高而增強。Fluo-3/AM進 入細胞后可以被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-3 ,從而被滯留在細胞內(nèi)。Fluo-3可以和鈣離子結合,結合鈣離子后可以產(chǎn)生較強的熒光,大激發(fā)波長為506 nm ,大發(fā)射波長為526nm。實際檢測時*使用的激發(fā)波長為488 nm左右,發(fā)射波長為525-530 nm。
細胞鈣離子檢測實驗步驟：
1)用激光共聚焦培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞。去除培養(yǎng)基后,用PBS洗滌細胞,然后加入適量含有fluo-3/AM的PBS緩沖液( fluo-3/AM終濃度為0.5-5μM ),置于37°C避光孵育 30分鐘。探針濃度和負載時間需要根據(jù)細胞類型進行調(diào)整,可查閱文獻。
2)用PBS溶液輕洗2次,再加入PBS緩沖液，繼續(xù)孵育20 min , 37°C ,確保fluo-3/AM在胞內(nèi)*水解成fuo-3。
3)用LCSM采集熒光信號, 激發(fā)波長488 nm ,發(fā)射波長525 nm。
注意:此處理方法適用于貼壁細胞。如果是懸浮細胞或半懸浮細胞,可低速離心收集細胞后,進行處理，
然后取細胞懸液滴在共聚焦蓋玻片上直接觀察。